炭疽桿菌(BA)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
【產品名稱】 將步驟 1 提取的 DNA、陽性質控品、陰性質控品各取 4μL,分別加入相應的反
通用名稱:炭疽桿菌(BA)核酸檢測試劑盒(熒光-PCR 法)
應管中,蓋好管蓋,混勻,短暫離心。
Name :Bacillus Anthracis Detection Kit (Real-Time PCR Method) 4 擴增(核酸擴增區)
【包裝規格】48T/盒
炭疽是由炭疽桿菌(Bacillus Anthracis, BA)感染引起的一種人獸共患病。BA 在環境中形成芽孢,可長期、穩定地存在于自然界中。由于 BA 的穩定性及其致病性,易引發突發公共衛生事件。目前的 BA 檢測方法主要基于病原體的培養、染色鏡檢、血清學檢測等,但這些方法均不適合早期的快速偵檢?;诤怂釞z測的熒光-PCR技術,因其靈敏度高、操作簡單、特異性好,可快速檢測炭疽病原,及時控制炭疽疫
4.1 將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內;
4.2 設置好通道、樣品信息,反應體系設置為 25μL;熒光通道選擇: 檢測通道(Reporter Dye)FAM, 淬滅通道(Quencher Dye)NONE,ABI 系列儀器請勿選擇 ROX 參比熒光,選擇 None 即可。
4.3 推薦循環參數設置:
情 。
[1] 本試劑盒適用于檢測皮膚水泡液、咽拭子、可疑食物等樣本中的炭疽桿菌,用于炭疽桿菌感染的輔助診斷。 5 結果分析判定
【檢驗原理】
6.1 結果分析條件設定
本試劑對炭疽桿菌特異性基因設計引物和熒光探針[2-3],用熒光 PCR 技術對炭疽 設置 Baseline 和 Threshold:一般直接按機器自動分析的結果分析,當曲線出現桿菌的核酸進行體外擴增檢測,用于臨床上對可疑感染者的病原學診斷。
【試劑組成】
整體傾斜時,根據分析后圖像調節 Baseline 的 start 值(一般可在 3~15 范圍內調
節)、stop 值(一般可在 5~20 范圍內調節),以及 Threshold 的 Value 值(上下拖動閾值線至高于陰性對照),重新分析結果。
名 稱 規 格
核酸提取液酶液
BA 反應液
BA 陽性質控品
陰性質控品
注:
1.5mL×2 管
50μL×1 管
1.0mL×1 管
50μL×1 管
250μL×1 管
7結果判斷
陽性:檢測通道 Ct 值≤35.0,丏曲線有明顯的指數增長曲線。
可疑:檢測通道 Ct 值>35.0,丏出現明顯擴增曲線的樣本建議重復試驗,重復試驗結果出現 Ct 值≤35.0 和明顯擴增曲線者為陽性,否則為陰性。
陰性:樣本檢測結果無 Ct 值丏無明顯的擴增曲線。
1) 不同批號試劑不能混用。 Ø 樣本檢測結果不樣本收集、處理、運送以及保存質量有關;
2) 試劑盒內各試劑組份足夠包裝規格所標示的檢測次數。
-20℃±5℃,避光保存、運輸、反復凍融數不超過 5 次,有效期 12 個月。
ABI 、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、eppendorf 等系列
Ø 樣本提取過程中沒有控制好交叉污染,會出現假陽性結果;
Ø 陽性對照、擴增產物泄漏,會導致假陽性結果;
Ø 病原體在流行過程中基因突變、重組,會導致假陰性結果;
Ø 不同的提取方法存在提取效率差異,會導致假陰性結果;
Ø 試劑運輸,保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降,出現假陰性或定 量檢測不準確的結果;熒光定量 PCR 檢測儀。 Ø 本檢測結果僅供參考,如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。
【標本采集】
皮膚炭疽,取水泡液 1mL;肺炭疽,采集咽拭子標本,放入標本采集管中;腸炭疽,取糞便 1g
上述標本短期內可保存于-20℃,長期保存可置-70℃,但不能超過 6 個月,標本運送應采用 2~8℃冰袋運輸,嚴禁反復凍融。
9. 質控標準
陰性質控品:無明顯擴增曲線或無 Ct 值顯示;
陽性質控品:擴增曲線有明顯指數生長期,丏 Ct 值≤32;
以上條件應同時滿足,否則實驗視為無效。
Ø 所有操作嚴格按照說明書進行;
Ø 試劑盒內各種組分使用前應自然融化,*混勻并短暫離心;
Ø 反應液應避光保存;
1. . 樣品處理(樣本處理區) Ø 反應中盡量避免氣泡存在,管蓋需蓋緊;
1.1 1 樣本前處理
固體樣本:手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨,加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨,待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中,8000rpm 離心 2min,取上清液 100μ
L 于 1.5mL 滅菌離心管中;液體樣本:直接取 100μL 于 1.5mL 滅菌離心管中。
1 111 提取
1) 對上述處理好的標本加入 50μL 核酸提取液,100℃恒溫處理 10min,13,000rpm 離心 5min,取上清液轉移至新的 1.5mL EP 管,-20℃保存;
2) DNA 的提取也可以采用深圳綠食源生物技術有限公司生產的 DNA 提取試劑盒(離心柱提取法),請嚴格按照試劑盒說明書進行操作。
2. 試劑配制(試劑準備區)
根據待檢測樣本總數,設所需要的 PCR 反應管管數為 N(N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照;樣品每滿 7 份,多配制 1 份),每測試反應體系配制如下表:
Ø 使用一次性吸頭、一次性手套和各區與用工作服;
Ø 樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行,以免交叉污染;
Ø 實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器;
Ø 試劑盒里所有物品應視為污染物對待,并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通 則》進行處理。
試劑 BA 反應液 酶液
用量(樣本數為 N)20μL
1μL將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中,21uL/管。
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